一种血清总胆汁酸的测定试剂及检测方法

本发明提供了一种用于血清中总胆汁酸测定的组合试剂A和检测方法，组合试剂A包含由Tris-HCl缓冲液、3α-羟基类固醇脱氢酶（3α-HSD）、辅酶（NAD

1.一种用于血清总胆汁酸检测的组合试剂A，其特征在于包含由Tris-HCl缓冲液、3α-羟基类固醇脱氢酶、氧化型辅酶NAD⁺或还原型辅酶NADH构成的试剂I；和由心肌黄酶、2,6-二氯酚靛酚DCPIP、Tris-HCl缓冲液构成的试剂II。
2.如权利要求1所述一种用于血清总胆汁酸检测的组合试剂A，其特征在于所述的试剂I、试剂II中各组分含量：试剂I中为氧化型辅酶NAD⁺时：1）每升试剂I中各组分的含量：3α-羟基类固醇脱氢酶：0.02-0.05g/L氧化型辅酶NAD⁺：5-30mMpH8.0的Tris-HCl缓冲液：50mM2）每升试剂II中各组分的含量：心肌黄酶：0.02-0.05g/LDCPIP：0.2-0.5mMpH8.0的Tris-HCl缓冲液：50mM试剂I中为还原型辅酶NADH时：1）每升试剂I中各组分的含量：3α-羟基类固醇脱氢酶：0.005-0.05g/L还原型辅酶NADH：0.5-1.0mMpH8.0的Tris-HCl缓冲液：50mM2）每升试剂II中各组分的含量：心肌黄酶：0.005-0.05g/L2,6-二氯酚靛酚：0.2-0.5mMpH8.0的Tris-HCl缓冲液：50mM。
3.一种用于血清总胆汁酸检测的测定方法，其特征在于将权利要求1所述的试剂I和试剂II按照等体积混合后，得到组合试剂A，将已知浓度的胆汁酸溶液样品加入到A中，利用紫外分光光度法连续检测600nm处吸光度的变化，计算出反应速率，绘制已知胆汁酸浓度和反应速率之间的工作曲线；将待检测的含有胆汁酸的血清样品加入到A中，同样利用紫外分光光度法连续检测600nm处吸光度的变化，计算出反应速率，即可根据工作曲线定量计算血清样品中的总胆汁酸浓度。
4.一种用于血清总胆汁酸检测的固定化组合试剂B，其特征在于制备步骤包括:1）将一定质量的3α-羟基类固醇脱氢酶、心肌黄酶、还原型辅酶（NADH）或氧化型 辅酶（NAD⁺）溶解于水中得到组合试剂B溶液；将该组合试剂B溶液与甘油充分混合，其中溶液与甘油的体积比为10：90―5：95；将该混合液作为同轴共纺静电纺丝的内相溶液，加入到微量进样器中；2）将一定质量高分子聚合物溶于有机溶剂中充分溶解，得到的透明溶液作为同轴共纺静电纺丝的外相电纺液，加入到另一微量进样器中，其中外相电纺液是溶于N,N-二甲基乙酰胺的重量百分比为10～30％的聚氨酯溶液、溶于N,N-甲基乙酰胺的重量百分比为10～30％的聚偏氟乙烯溶液、溶于氯仿的重量百分比为10～30％的聚乳酸溶液、溶于水的重量百分比为3～10％的聚环氧乙烷溶液、或溶于N,N-二甲基乙酰胺的苯乙烯马来酸酐共聚物溶液；3）将内、外相电纺液分别通过管线连接至同轴电纺喷丝头的进液口，将喷丝头的出液口与高压电源的正极连接，用铝箔纸或不锈钢网连接至高压电源的负极作为接收板；4）利用两台注射泵分别控制内、外相电纺液的流速，进行同轴静电纺丝，在接收板上得到具有中空结构的聚合物纳米纤维，其中用于血清总胆汁酸检测的组合试剂B被原位包埋在这种中空纳米纤维的空腔中，从而制备出用于血清总胆汁酸检测的固定化组合试剂B。
5.如权利要求4所述的用于血清总胆汁酸检测的固定化组合试剂B，其特征在于所制备出的固定化组合试剂B具有无纺布膜的形态，原位包埋在中空纳米纤维中的3α-羟基类固醇脱氢酶、心肌黄酶、还原型辅酶（NADH）或氧化型辅酶（NAD⁺）在中空纳米纤维的腔室中，保持游离分散的状态。
6.利用权利要求4所述的固定化组合试剂B进行胆汁酸检测的方法，其特征在于：在含有已知浓度胆汁酸的Tris-HCl缓冲液中，添加DCPIP溶液使其终浓度为0.04mM，然后再加入所述步骤4）中所制备出的用于血清总胆汁酸检测的固定化组合试剂B，采用分光光度计连续每隔30s检测600nm处吸光度值的改变，计算出反应速率，绘制已知胆汁酸浓度和反应速率之间的工作曲线；在待检测的含有胆汁酸的血清样品中，添加DCPIP溶液使其终浓度为0.04mM，然后加入步骤4）中所制备出的用于血清总胆汁酸检测的固定化组合试剂B，同样利用紫外分光光度法连续检测600nm处吸光度的变化，计算出反应速率，即可根据工作曲线定量计算血清样品中的总胆汁酸浓度。