用于扩增产氢微藻莱茵衣藻插入突变基因侧翼序列的引物及方法

本发明公开了一种用于扩增产氢微藻莱茵衣藻插入突变基因侧翼序列的引物及方法。本发明提供了序列表的序列1、序列2所示DNA、兼并引物和序列表的序列8所示DNA组成的引物组合物；所述兼并引物为针对莱茵衣藻的基因组DNA的兼并引物。应用本发明提供的引物组合物可以获得莱茵衣藻突变体的基因组DNA中巴龙霉素编码基因的插入位点。本发明提供的方法，将设计的两条特异性引物与TAIL-PCR所用的简并引物进行组合，在优化的PCR反应条件下，可高效特异的扩增插入突变基因侧翼序列。本发明对高通量克隆莱茵衣藻基因、研究基因功能具有重要意义。

1.序列表的序列1所示DNA、序列表的序列2所示DNA、兼并引物和序列表的序列8所示DNA组成的引物组合物；所述兼并引物为针对莱茵衣藻的基因组DNA的兼并引物。
2.如权利要求1所述的引物组合物，其特征在于：所述兼并引物为序列表的序列7所示DNA、序列表的序列3所示DNA、序列表的序列4所示DNA、序列表的序列5所示DNA或序列表的序列6所示DNA。
3.一种获得莱茵衣藻突变体的基因组DNA中巴龙霉素编码基因的插入位点的方法，包括如下步骤：(1)提取莱茵衣藻突变体的基因组DNA；(2)以基因组DNA为模板，用序列表的序列1所示DNA和所述兼并引物作为引物进行第一轮PCR扩增，得到第一轮PCR扩增产物；(3)以第一轮PCR扩增产物为模板，用序列表的序列2所示DNA和序列表的序列8所示DNA作为引物进行第二轮PCR扩增，得到第二轮PCR扩增产物；(4)将第二轮PCR扩增产物进行测序，通过与野生型莱茵衣藻的基因组序列进行比对，得到莱茵衣藻突变体的基因组DNA中巴龙霉素编码基因的插入位点；所述莱茵衣藻突变体是在莱茵衣藻中导入PSI103质粒得到的突变体。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述第一轮PCR扩增的反应条件如下：(1)93℃2分钟；(2)95℃1分钟；(3)94℃30秒，68℃1分钟，72℃3分钟，11个循环；(4)94℃30秒，25℃2分钟，以0.5度/秒的速度升温至72℃，72℃3分钟；(5)94℃20秒，68℃1分钟，72℃3分钟，26个循环；(6)72℃5分钟。
5.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于：所述第二轮PCR扩增的反应条件如下：(1)94℃20秒，67℃1分钟，72℃3分钟，2个循环；(2)94℃20秒，68℃1分钟，72℃3分钟，94℃20秒，68℃1分钟，72℃3分钟，94℃20秒，50℃1分钟，72℃3分钟，14个循环；(3)72℃5分钟。
6.权利要求1或2所述引物组合物在获得莱茵衣藻突变体的基因组DNA中巴龙霉素编码基因的插入位点中的应用。
7.权利要求1或2所述的引物组合物在辅助鉴定莱茵衣藻的基因组DNA中各基因功能中的应用。
8.权利要求3或4或5所述方法在辅助鉴定莱茵衣藻的基因组DNA中各基因功能中的应用。
9.一种辅助鉴定莱茵衣藻的基因组DNA中各基因功能的试剂盒，包括PSI103质粒和权利要求1或2所述引物组合物。