一种用于新一代测序分析的多重目的DNA片段富集方法

本发明公开了一种DNA测序模板的制备方法。该方法包括如下步骤：（1）将待测序的DNA分子依次进行片段化、末端修复和补齐，3’端加A，以及连接接头；（2）通过三轮半巢式PCR扩增富集目的DNA片段；前两次PCR所用引物均为一条特异性引物和一条通用引物；第三次PCR所用引物由两条通用引物组成；前两次PCR可为多重PCR反应。与Illumina？GA样品前处理过程相比，本发明所提供的方法减少了样品处理的步骤，节约了时间和经济成本，同时降低了起始DNA样品的需求量；最重要的是，循环数的降低和Phusion高保真DNA聚合酶的使用降低了由于PCR而引入的突变，使得对所得数据的处理变得相对简单清晰，同时本方法在应用到各种重测序的实验中时对测序深度的要求也降低。

1.DNA测序模板的制备方法，包括如下步骤：(1)将具有待测序位点的DNA样品依次进行片段化、末端修复和补齐，3’端加A，以及连接接头，得到用于第一次PCR反应的模板；所述待测序位点的上游核苷酸序列已知，且存在PCR特异引物对应的特异区域；所述接头为由长链和短链组成的一端是平末端另一端是5’粘性末端的双链DNA，所述长链的5’端突出；(2)用特异性引物1ros和通用引物1对步骤(1)得到的用于第一次PCR反应的模板进行第一次PCR扩增，得到包含所述待测序位点的DNA片段；所述特异性引物1ros与所述特异区域互补；所述通用引物1的序列含有选自步骤(1)所述接头中所述长链的5’端突出部分的序列；(3)用特异性引物2ros和通用引物2对步骤(2)得到的所述DNA片段进行第二次PCR扩增，得到包含所述待测序位点的DNA片段；所述特异性引物2ros自5’端至3’端分为片段1和片段2，所述片段2与所述特异区域互补，且所述特异性引物2ros自3’端起第一个核苷酸与所述待测序位点之间的距离比所述特异性引物1ros自3’端起第一个核苷酸与所述待测序位点之间的距离更近；所述片段1与所述待测序位点的上游不互补；所述通用引物2的序列选自步骤(1)所述接头中所述长链的5’端突出部分的序列；(4)用通用引物3和通用引物4对步骤(3)得到的所述DNA片段进行第三次PCR扩增，得到DNA测序模板；所述通用引物3的自5’端至3’端分为片段3和片段4，所述片段4选自步骤(3)所述片段1，所述片段3为如下a)：a)AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCC；所述通用引物4自5’端至3’端分为片段5和片段6，所述片段6选自步骤(1)所述接头中所述长链的5’端突出部分的序列，所述片段5为如下b)：b)CAAGCAGAAGACGGCATA。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：权利要求1步骤(2)-(4)的三次所述PCR反应所用的DNA聚合酶均为Phusion高保真DNA聚合酶。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述接头中所述长链的序列如序列表中序列1-10所示，所述接头中所述短链的序列为如下中的任一种：A)序列表中序列1的自3’端起倒数第9位-倒数第2位的反向互补序列；B)序列表中序列2-序列10中任一个的自3’端起倒数第10位-倒数第2位的反向互补序列。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：用于所述第一次PCR反应的所述通用引物1序列为序列表中序列11。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：用于所述第二次PCR反应的所述通用引物2序列为序列表中序列12。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：用于所述第三次PCR反应的所述通用引物3和所述通用引物4的序列分别为序列表中序列13和14。