一种改性壳聚糖的生产方法

本发明属于生物工程领域，涉及壳聚糖改性，本发明通过加入蛋白或多肽，加入谷氨酰胺转胺酶，调节pH，充分反应后，去除沉淀，脱盐，干燥进行改性。本发明技术方案生产的改性壳聚糖水溶性好，pH3-10不沉淀，粘度小，还保留壳聚糖原有强吸附性、抗菌性等功能，具有广阔的应用前景。

技术领域
本发明属于生物工程领域，尤其涉及一种改性壳聚糖的生产方法。技术背景壳聚糖(chitosan)是由自然界广泛存在的几丁质(chitin)经过脱乙酰作用得到的，化学名称为聚葡萄糖胺(1-4)-2-氨基-B-D葡萄糖。由于它的大分子结构中存在大量氨基而带有大量的正电荷，因而对带负电荷的各类有害物质具有强大的吸附作用。这种天然高分子的生物官能性和相容性、血液相容性、安全性、微生物降解性等优良性能被各行各业广泛关注，具有控制胆固醇、抑制细菌、预防和控制高血压 、吸附和排泄重金属、保持湿度、增强免疫等生理功效，在医药、食品、化工、化妆品、水处理、金属提取及回收、生化和生物医学工程等诸多领域的应用研究取得了重大进展。然而，壳聚糖只能溶于一些稀的无机酸或有机酸中，不能直接溶于水中，这在很大程度上限制了它的应用。为了解决这一问题，人们通过采用一系列方法，使壳聚糖能溶于水。如：①各种能溶于水的壳聚糖无机酸或有机酸酸盐，如壳聚糖盐酸盐、壳聚糖乳酸盐和壳聚糖柠檬酸盐等；②通过化学或生物的方法使壳聚糖降解为能溶于水的低分子量壳聚糖；③能溶于水的壳聚糖化学修饰物，如：羧甲基壳聚糖等；④通过化学反应对壳聚糖的酰化程度进行精确控制，控制其酰化度在50%~60%。但是，这些方法都存在一些缺陷，如壳聚糖无机酸或有机酸酸盐虽然溶于水，但在pH值大于6.2时会沉淀析出；低分子量壳聚糖的生理活性如抗菌性、吸附性等大大降低或消失；壳聚糖化学修饰物存在一定的安全性问题，同时其生理活性也存在改变或丧失；对壳聚糖的酰化程度进行精确控制不仅较难实现，在安全性和生理活性方面也存在同样问题。
发明内容
为了解决壳聚糖溶解性低，pH值大于6.2时会沉淀析出，粘度大等问题，本发明提供一种水溶性好，pH3-10不沉淀，粘度小，还保留壳聚糖原有强吸附性、抗菌性等功能的改性壳聚糖生产方法，具体技术方案如下：一种改性壳聚糖的生产方法，包含下列步骤：（1）取壳聚糖溶于有机酸或无机酸溶液中，调节pH4.0-6.2，（2）加入酰基供体，再加入谷氨酰胺转胺酶，25-85℃充分反应，调节pH6.2-7.0，过滤去除沉淀，脱盐，干燥；所述壳聚糖或壳聚糖无机酸盐：酰基供体：谷氨酰胺转胺酶质量比为=1：0.01-1：0.1；所述加入酰基供体为加入蛋白质或多肽利用其谷氨酰胺残基的γ-羧酰胺基作为酰基供体。所述无机酸或有机酸溶液为0.1-1mol/L的盐酸、乙酸、乳酸或柠檬酸；所述谷氨酰胺转胺酶为2000U/g。为了达到更好的效果：调节pH为6.2；所述酰基供体为明胶蛋白、大豆蛋白、酪蛋白、胶原蛋白、丝素蛋白、多肽中的一种或几种的混合物，优选为明胶蛋白；所述多肽优选为谷胱甘肽。所述壳聚糖：酰基供体：谷氨酰胺转胺酶质量比为1：0.2：0.1 。所述的脱盐采取透析或超滤脱盐；所述干燥为喷雾干燥或真空干燥。改性后的壳聚糖为聚葡萄糖胺(1-4)-2-氨基-B-D葡萄糖的衍生物，pH3-10条件下能溶解。谷氨酰胺转氨（胺）酶，别名：转谷氨酰胺酶，英文名称：Glutamine trasaminase （TG），可来源于动物、植物和微生物，是一种催化蛋白质间（或内）酰基转移反应，其可催化蛋白质多肽发生分子内和分子间发生共价交联，从而改善蛋白质的结构和功能，对蛋白质的性质如：发泡性，乳化性，乳化稳定性，热稳定性、保水性和凝胶能力等效果显著，进而改善食品的风味、口感、质地和外观等， 在食品加工领域有广泛的应用，可应用于水产加工品、火腿、香肠、面类、豆腐等等。本发明涉及壳聚糖的生物改性，可使壳聚糖在保留原有吸附、絮凝、抗菌等功能的同时，可溶于水，且在pH值大于6.2时可不沉淀，其溶解性能在pH值大于6.2时比未改性的壳聚糖显著提高，并可降低壳聚糖的粘度，从而大大增强壳聚糖的适用范围。其基本原理是：利用谷氨酰胺转胺酶的转酰基功能，将含有谷氨酰胺或含有谷氨酰胺的各种物质（蛋白质、肽等）与壳聚糖的伯胺基通过酰胺键连接，从而达到壳聚糖的生物改性的目的。本发明技术方案进行壳聚糖生物改性具有如下有益效果：1、  改性后的壳聚糖水溶性好，pH 值在3.0-10.0之间可不沉淀，可使壳聚糖在保留原有吸附、絮凝、抗菌等功能的同时，适用范围更广，尤其适用于人体的生理环境；3、  可降低壳聚糖的粘度，从而大大增强壳聚糖的适用范围；4、  原料为使用食品级或医药级原料（TG酶、蛋白质和多肽等），具有生物官能性和相容性、血液相容性、安全性、微生物降解性等特性，安全性好；5、  酶促反应条件温和、反应效率高，环境友好型；6、通过本发明生产的改性壳聚糖，在保留壳聚糖原有生物活性的同时，由于具有水溶性和更宽的pH适用范围，并且更加安全可靠，尤其适用于人体的生理pH环境，其在医药卫生、保健治疗、食品加工、化工和生物工程等领域都有着具大的应用价值。
具体实施方式
实施例1 壳聚糖明胶蛋白的生物合成及应用壳聚糖明胶蛋白的生物合成：取壳聚糖100克，溶于0.1-1.0 M(mol/L下同)的盐酸中(或取100克壳聚糖盐酸盐，溶于水中)，用0.1N的NaOH或0.1N 的NaHCO₃调溶液的pH值到4.0-6.2，加入明胶蛋白1-100克（提前溶于水中），加入TG酶5克(2000 U/g)，于25℃-85℃反应1-48小时，反应结束后，用0.1N的NaOH或0.1N 的NaHCO₃调溶液的pH值到6.2-7.0，过滤去沉淀，透析或超滤脱盐后，喷雾干燥或真空干燥，即可得壳聚糖明胶蛋白。实施例2 取壳聚糖100克，溶于0.1-1.0 M的盐酸中(或取100克壳聚糖盐酸盐，溶于水中)，用0.1N的NaOH或0.1N 的NaHCO₃调节pH6.2。加入酰基供体明胶蛋白，再加入2000 U/g谷氨酰胺转胺酶，25-85℃充分反应，反应结束后，用0.1N的NaOH或0.1N 的NaHCO₃调节pH6.2，过滤去除沉淀，脱盐，喷雾干燥或真空干燥；壳聚糖或壳聚糖无机酸盐：明胶蛋白：谷氨酰胺转胺酶质量比为=1：0.2：0.1。实施例3 壳聚糖胶原蛋白的生物合成及应用取壳聚糖100克，溶于0.1-1.0 M的盐酸中(或取100克壳聚糖盐酸盐，溶于水中)，用0.1N的NaOH或0.1N 的NaHCO₃调溶液的pH值到4.0-6.2，加入胶原蛋白1-100克（提前溶于水中），加入TG酶5克，于25℃-85℃反应1-48小时，反应结束后，用0.1N的NaOH或0.1N 的NaHCO₃调溶液的pH值到6.2-7.0，过滤去沉淀，透析或超滤脱盐后，喷雾干燥或真空干燥，即可得壳聚糖胶原蛋白。实施例4 壳聚糖大豆蛋白的生物合成及应用取壳聚糖100克，溶于0.1-1.0 M的乙酸中(或取100克壳聚糖乙酸盐，溶于水中)，用0.1N的NaOH或0.1N 的NaHCO₃调溶液的pH值到4.0-6.2，加入大豆蛋白1-100克（提前溶于水中），加入TG酶15克，于25℃-85℃反应1-48小时，反应结束后，用0.1N的NaOH或0.1N 的NaHCO₃调溶液的pH值到6.2-7.0，过滤去沉淀，透析或超滤脱盐后，喷雾干燥或真空干燥，即可得壳聚糖大豆蛋白。实施例5 壳聚糖酪蛋白的生物合成及应用取壳聚糖100克，溶于0.1-1.0 M的乳酸中(或取100克壳聚糖乳酸盐，溶于水中)，用0.1N的NaOH或0.1N 的NaHCO₃调溶液的pH值到4.0-6.2，加入酪蛋白1-100克（提前溶于水中），加入TG酶6克，于25℃-85℃反应1-48小时，反应结束后，用0.1N的NaOH或0.1N 的NaHCO₃调溶液的pH值到6.2-7.0，过滤去沉淀，透析或超滤脱盐后，喷雾干燥或真空干燥，即可得壳聚糖酪蛋白。实施例6 壳聚糖谷胱甘肽的生物合成及应用取壳聚糖100克，溶于0.1-1.0 M的柠檬酸中(或取100克壳聚糖柠檬酸盐，溶于水中)，用0.1N的NaOH或0.1N 的NaHCO₃调溶液的pH值到4.0-6.2，加入谷胱甘肽0.1-20克（提前溶于水中），加入TG酶12克，于25℃-85℃反应1-48小时，反应结束后，用0.1N的NaOH或0.1N 的NaHCO₃调溶液的pH值到6.2-7.0，过滤去沉淀，透析或超滤脱盐后，喷雾干燥或真空干燥，即可得壳聚糖谷胱甘肽。实施例7壳聚糖卵清蛋白的生物合成及应用取壳聚糖100克，溶于0.1-1.0 M的盐酸中(或取100克壳聚糖盐酸盐，溶于水中)，用0.1N的NaOH或0.1N 的NaHCO₃调溶液的pH值到4.0-6.2，加入卵清蛋白1-100克（提前溶于水中），加入TG酶5克，于25℃-85℃反应1-48小时，反应结束后，用0.1N的NaOH或0.1N 的NaHCO₃调溶液的pH值到6.2-7.0，过滤去沉淀，透析或超滤脱盐后，喷雾干燥或真空干燥，即可得壳聚糖卵清蛋白。实施例8 壳聚糖丝素蛋白的生物合成及应用取壳聚糖100克，溶于0.1-1.0 M的盐酸中(或取100克壳聚糖盐酸盐，溶于水中)，用0.1N的NaOH或0.1N 的NaHCO₃调溶液的pH值到4.0-6.2，加入丝素蛋白1-100克（提前溶于水中），加入TG酶5克，于25℃-85℃反应1-48小时，反应结束后，用0.1N的NaOH或0.1N 的NaHCO₃调溶液的pH值到6.2-7.0，过滤去沉淀，透析或超滤脱盐后，喷雾干燥或真空干燥，即可得壳聚糖丝素蛋白。实施例9 改性壳聚糖的性能比较试验取实施例1所得改性壳聚糖（壳聚糖明胶蛋白），对其抑菌率、粘度和pH大于6.2时溶解度等指标进行测试，即可改性前后的壳聚糖性能比较如下表：