一种产异丁醇的运动发酵单孢菌基因工程菌及其构建方法

本发明涉及产异丁醇的运动发酵单胞菌（<i>Zymomonas？mobilis</i>）？ATCC？10988基因工程菌及其构建方法。本发明克隆得到乳酸乳球菌（<i>Lactococcus？lactis</i>）？1.2829中的2-酮异戊酸脱羧酶基因（<i>kivd</i>）和醇脱氢酶基因（<i>adh</i>A），并将其连接到含有氯霉素抗性的质粒pZY507上，构建得到重组质粒pZY507KA。将重组质粒电转化入<i>Z.？mobilis</i>中，筛选具有氯霉素抗性的菌株即为目标工程菌。本发明得到的基因工程菌经诱导后可以分解葡萄糖合成异丁醇，这是首次利用运动发酵单胞菌发酵法生产异丁醇，也显示了运动发酵单胞菌的巨大潜力与价值。

1.一种产异丁醇的运动发酵单胞菌基因工程菌的构建方法，其具体步骤如下：
（1）以GenBank中已报道的乳酸乳球菌2-酮异戊酸脱羧酶基因NCBIGeneID:1114953
为依据，设计引物，引物序列为SEQIDNO：3和SEQIDNO：4，利用PCR得到2-酮异戊酸脱羧
酶基因；
（2）以GenBank中已报道的乳酸乳球菌醇脱氢酶基因NCBIGeneID:1115472为依据，
设计引物，引物序列为SEQIDNO：5和SEQIDNO：6，利用PCR得到醇脱氢酶基因；
（3）表达载体的构建：
1）将步骤（1）所得的kivd基因经SacI和BamHI双酶切后与用相同内切酶酶切后的表达
载体pZY507连接，鉴定正确后，获得重组质粒pZY507K；
2）将步骤（2）所得的adhA基因经BamHI和SalI双酶切后与用相同内切酶酶切后的重组
质粒pZY507K连接，鉴定正确后，获得重组质粒pZY507KA；
（4）转化：重组质粒pZY507KA电转化入表达宿主运动发酵单胞菌中，构建基因工程菌，
鉴定正确后即为产异丁醇的运动发酵单胞菌基因工程菌。