一株产α-酮基丁酸的基因工程菌及其应用

本发明涉及一种生产α-酮基丁酸的基因工程菌及其构建方法和应用，利用该菌株发酵生产α-酮基丁酸具有较高的生产效率，属于生物技术领域。所述基因工程菌是对大肠杆菌Escherichia coli MG1655进行基因工程改造获得的菌；所述基因工程改造为过表达的苏氨酸脱水酶编码基因ilvA、敲除乙酰羟基酸合成酶Ⅰ大亚基编码基因ilvB、乙酰羟基酸合成酶Ⅲ大亚基编码基因ilvI以及苏氨酸操纵子前导肽编码基因thrL。使用该菌采用发酵法生产α-酮基丁酸能够克服化学合成法、酶法或微生物转化法存在的反应条件复杂、能耗大、污染重或生产成本高污染大等不足，在发酵20-24h后，α-酮基丁酸产量达到8.5-15.7g/L，该发酵过程为好氧发酵，菌体生长快，发酵周期短，产酸速率高，目前未见直接发酵法生产α-酮基丁酸的报道。

1.一种基因工程菌，是对出发菌株大肠杆菌(Escherichia coli)MG1655进行基因工程改
造获得的菌；所述基因工程改造为过表达苏氨酸脱水酶编码基因ilvA，并敲除乙酰羟基酸合
成酶Ⅰ大亚基编码基因ilvB、乙酰羟基酸合成酶Ⅲ大亚基编码基因ilvI及以及苏氨酸操纵子
前导肽编码基因thrL。
2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于：所述苏氨酸脱水酶编码基因ilvA
来自大肠杆菌E.coli MG1655，GeneID:948287，核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO：1。
3.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于：所述乙酰羟基酸合成酶Ⅰ大亚基编
码基因ilvB的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2，所述乙酰羟基酸合成酶Ⅲ大亚基编
码基因ilvI的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：3，所述苏氨酸操纵子前导肽编码基因thrL
的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：4。
4.一种构建权利要求1所述的基因工程菌的方法，包括如下步骤：
（一）ilvB基因的敲除
（1）采用PCR技术以大肠杆菌MG1655基因组为模板，根据MG1655中ilvB(GeneID:
948181)基因5’和3’端400bp序列设计同源臂引物，扩增获取ilvB基因的上下游同源臂；
（2）采用PCR技术以pKD3质粒为模板，设计引物，扩增氯霉素抗性基因盒片段；
（3）以步骤（1）、（2）获得的扩增片段为模板通过重叠PCR获得ilvB基因敲除片段，
所述基因敲除片段由乙酰羟基酸合成酶Ⅰ大亚基编码基因ilvB的上、下游同源臂基因片段以
及氯霉素抗性基因盒片段组成；
（4）将上述基因敲除片段导入含有pKD46质粒的出发菌株感受态细胞中，获得阳性转
化子，消除阳性转化子中的氯霉素抗性基因后获得ilvB基因敲除菌；
（二）ilvI基因的敲除
（1）以步骤（一）中(1)-(3)相同的的方法构建ilvI(GeneID:947267)基因敲除片段，所述
ilvI基因敲除片段由ilvI的上、下游同源臂基因片段以及氯霉素抗性基因盒片段组成；
（2）将（二）-(1)中的基因敲除片段导入含有pKD46质粒的ilvB基因敲除菌感受态细胞
中获得阳性转化子，消除阳性转化子中的氯霉素抗性基因后获得ilvB、ilvI基因敲除菌；
（三）thrL基因的敲除
（1）以步骤（一）中1-3相同的的方法构建thrL(GeneID:948283)基敲除片段；
（2）将（三）-(1)中的基因敲除片段导入含有pKD46质粒的ilvB、ilvI基因敲除菌感受
态细胞中获得阳性转化子，消除阳性转化子中的氯霉素抗性基因后获得ilvB、ilvI、thrL基因
敲除菌；
（四）ilvA基因的过表达
将ilvA基因及其表达载体pWSK29用Xba I和BamH I进行双酶切后连接，连接产物转
化至上述ilvB、ilvI、thrL基因敲除菌，通过菌落PCR鉴定获得的阳性转化子即为本发明所述
的大肠杆菌基因工程菌。
5.权利要求1所述一种基因工程菌，其特征在于，出发菌株来自埃希氏菌属(Escherichia)、
棒杆菌属(Corynebacterium)、节杆菌属(Arthrobacter)、假单胞菌属(Pseudomounas)或芽孢杆菌
属(Bacillus)。
6.权利要求1所述的基因工程菌在发酵法生产α-酮基丁酸中的应用。
7.利用权利要求1所述的基因工程菌发酵生产α-酮基丁酸的方法，步骤如下：
（1）种子培养：将本发明所述的基因工程菌活化后，接种至装有1L种子培养基的5L
发酵罐，流加25%W/V的氨水调节发酵液pH至6.8-7.2，溶氧维持在30-50%，通风量3-5m³/h，
搅拌转速200-600rpm，32-37℃培养6-8h。
（2）发酵罐发酵：以5%-10%接种量将步骤(1)的种子培养物接至装有6L发酵培养基的
10L发酵罐进行发酵培养，发酵温度32-37℃，通风量3-5m³/h，搅拌转速300-1000rpm，溶氧
维持在30-60%，流加浓度为60-80%W/V的葡萄糖溶液，维持残糖浓度为0.1-0.5%W/V，
流加25%W/V的氨水调节发酵液pH至6.8-7.2，发酵周期20-24h。
8.根据权利要求6所述的基因工程菌发酵生产α-酮基丁酸的方法，其特征在于：发酵
液中α-酮基丁酸的检测方法如下：发酵液经8000×g离心10min后取上清液并用去离子水稀
释5倍后，采用高效液相色谱仪测定α-酮基丁酸的含量，检测条件为：色谱柱
REzex RoA-organic Acid H+，流动相5mmol/L H₂SO₄，流速0.5mL/min，柱温30℃，检测
波长215nm，进样量为20μL。
9.根据权利要求6所述的基因工程菌发酵生产α-酮基丁酸的方法，其特征在于：
所述种子培养基成分为：蔗糖15-25g/L，玉米浆15-25mL/L，酵母粉1-4g/L，(NH₄)₂SO₄
1-4，KH₂PO₄0.5-1.5g/L，MgSO₄0.1-0.5g/L，FeSO₄·7H₂O0.01-0.05g/L，MnSO₄·H₂O
0.010.05g/L，pH7.0，0.075MPa高压蒸汽灭菌15min；
所述发酵培养基成分为：葡萄糖15-45g/L，酵母粉1-2g/L，豆饼水解液5-15mL/L，玉
米浆5-15mL/L，KH₂PO₄1-5g/L，柠檬酸0.5-2g/L，MgSO₄0.5-1g/L，FeSO₄·7H₂O0.1-0.5g/L，
MnSO₄·H₂O0.1-0.5g/L，pH7.0，0.075MPa高压蒸汽灭菌15min。