sn-2位为二十二碳六烯酸的磷脂酰丝氨酸的制备方法

本发明涉及一种利用高活力磷脂酶A和高活力磷脂酶D催化制备sn-2位为二十二碳六烯酸的磷脂酰丝氨酸(2-DHA-PS)的方法。通过重叠PCR技术实现定向进化，获得高活力磷脂酶A和高活力磷脂酶D；利用高活力磷脂酶A和高活力磷脂酶D催化制备2-DHA-PS，首先磷脂酰胆碱和丝氨酸在高活力磷脂酶D的催化下生成磷脂酰丝氨酸，然后磷脂酰丝氨酸再与二十二碳六烯酸在高活力磷脂酶A的催化下生成2-DHA-PS。该方法合成的产品中2-DHA-PS的相对含量较高，有效克服了现有合成方法的不足。

1.一种2-DHA-PS的制备方法，其特征在于，所述方法包括：丝氨酸与磷脂酰胆碱在高
活力磷脂酶D的催化下生成磷脂酰丝氨酸，磷脂酰丝氨酸与DHA在高活力磷脂酶A₂的催化
下生成2-DHA-PS；所述高活力磷脂酶A₂含有如SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列，是氨基
酸序列如SEQ ID NO：9所示的野生型磷脂酶A₂通过定点突变得到的突变体；所述高活力磷
脂酶D来源于专利CN102286440B。
2.如权利要求1所述的2-DHA-PS的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)将所述高活力磷脂酶D加入pH3.0-6.0的含有丝氨酸、CaCl₂的醋酸-醋酸钠缓冲液
中，与含有磷脂酰胆碱的乙醚等体积混合均匀，在30-50℃下反应6-16小时；其中，反应之
前高活力磷脂酶D浓度为1.0-4.0U/mL、丝氨酸的浓度为1.0-3.0M、CaCl₂的浓度为2.0mM；
(2)反应结束后静置分层，提取含磷酯酰丝氨酸的有机相；
(3)在步骤(2)得到的含磷酯酰丝氨酸的有机相中加入二十二碳六烯酸，然后与pH
4.0-9.0的含有高活力磷脂酶A₂、CaCl₂的磷酸盐缓冲液等体积混合均匀，在30-50℃下反应
6-16小时；其中，反应之前磷脂酶A₂浓度为10-40U/mL、CaCl₂的浓度为2.0mM；
(4)反应结束后静置分层，提取有机相并加入4-6倍体积的丙酮将生成的2-DHA-PS沉
淀下来，然后离心分离，收集沉淀并用丙酮洗涤2-4次，即可得到2-DHA-PS产品。
3.如权利要求2所述的2-DHA-PS的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述磷脂酰
胆碱的浓度为0.05-0.3M。
4.如权利要求2所述的2-DHA-PS的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述二十二
碳六烯酸的浓度为0.1-0.4M。
5.如权利要求1-4任一一项所述的2-DHA-PS的制备方法，其特征在于，以氨基酸序列
如SEQ ID NO：9所示的野生型磷脂酶A₂代替所述高活力磷脂酶A₂。
6.如权利要求1-4任一一项所述的2-DHA-PS的制备方法，其特征在于，所述高活力磷
脂酶A₂由枯草芽孢杆菌高活力磷脂酶A₂重组菌株、毕赤酵母高活力磷脂酶A₂游离表达重组
菌株或毕赤酵母细胞表面展示高活力磷脂酶A₂重组菌株制备。
7.如权利要求6所述的2-DHA-PS的制备方法，其特征在于，由枯草芽孢杆菌高活力磷
脂酶A₂重组菌株制备所述高活力磷脂酶A₂包括以下步骤：
(1)将野生型磷脂酶A₂基因与载体pUC-T连接，构建重组质粒pUC-T-plA₂，通过重叠
PCR定点突变野生型磷脂酶A₂基因，得到如SEQ ID NO：8所示高活力磷脂酶A₂突变体编
码基因；
(2)将高活力磷脂酶A₂突变体编码基因与大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒pBSA43连
接，构建获得携带有高活力磷脂酶A₂突变体编码基因的重组载体；
(3)将重组载体转化入枯草芽孢杆菌WB600中，构建获得重组菌株；
(4)将重组细胞进行发酵制备并提取高活力磷脂酶A₂；
(5)提取高活力磷脂酶A₂。
8.如权利要求6所述的2-DHA-PS的制备方法，其特征在于，由毕赤酵母细胞表面展示
高活力磷脂酶A₂重组菌株制备所述高活力磷脂酶A₂包括以下步骤：
(1)将野生型磷脂酶A₂编码基因与载体pUC-T连接，构建重组质粒pUC-T-plA₂，通过
重叠PCR定点突变野生型磷脂酶A₂基因，得到如SEQ ID NO：8所示高活力磷脂酶A₂突变
体编码基因；
(2)将高活力磷脂酶A₂突变体编码基因序列与毕赤酵母展示载体pPIC9K-Flo相连，得
到携带高活力磷脂酶A₂突变体编码基因的重组载体pPIC9K-Flo-plA₂m；
(3)将重组载体转化入宿主菌株毕赤酵母GS115中，得到毕赤酵母细胞表面展示磷脂
酶A₂重组菌株。
(4)将重组菌株发酵后制备酵母细胞表面展示高活力磷脂酶A₂全细胞催化剂。
9.如权利要求6所述的2-DHA-PS的制备方法，其特征在于，由所述毕赤酵母高活力磷
脂酶A₂游离表达重组菌株制备所述高活力磷脂酶A₂包括以下步骤：
(1)将野生型磷脂酶A₂基因与载体pUC-T连接，构建重组质粒pUC-T-plA₂，通过重叠
PCR定点突变野生型磷脂酶A₂基因，得到高活力磷脂酶A₂突变体编码基因；
(2)将高活力磷脂酶A₂突变体编码基因与表达载体pPIC9K相连，得到携带高活力磷
脂酶A₂突变体编码基因的重组表达载体；
(3)将重组载体转化入毕赤酵母GS115中，得到重组细胞；
(4)将得到的重组细胞经遗传霉素筛选，结合磷脂酶A₂的酶活测定，得到高活力磷脂
酶A₂的高产菌株；
(5)将高产菌株进行发酵制备高活力磷脂酶A₂；
(6)提取高活力磷脂酶A₂。
10.根据权利要求1-4任一一项所述方法制备的2-DHA-PS。