一种磷脂酶A2突变体及其制备方法

本发明涉及一种磷脂酶A突变体及其制备的方法，其技术方案是利用重组DNA技术定点突变来源于天蓝色链霉菌的野生型磷脂酶A的Glu37、Asp78的氨基酸残基，得到活力较高的磷脂酶A基因，然后将高活力磷脂酶A基因在枯草芽孢杆菌表达系统、毕赤酵母表达系统(包括毕赤酵母游离表达系统和毕赤酵母细胞表面展示系统)中表达，得到产高活力磷脂酶A的重组菌株，表达后，检测高活力磷脂酶A的比酶活较野生型磷脂酶A提高13.7％，其中枯草芽孢杆菌高活力磷脂酶A重组菌发酵后磷脂酶A的酶活可达到53.5U/ml，毕赤酵母游离表达高活力磷脂酶A重组菌的酶活可达106.4U/ml，毕赤酵母细胞表面展示高活力磷脂酶A全细胞催化剂的酶活可达260U/(g·干细胞)。

1.一种磷脂酶A₂突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。
2.权利要求1所述的磷脂酶A₂突变体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)通过重叠PCR定点突变野生型磷脂酶A₂基因，得到磷脂酶A₂突变体编码基因；
(2)将所述的磷脂酶A₂突变体编码基因酶切、连接到表达或展示载体，得到携带磷脂酶
A₂突变体编码基因重组载体；
(3)将重组载体转化至宿主细胞，得到重组菌株；
(4)表达所述的重组菌株，纯化获得如SEQ ID NO：8所示的磷脂酶A₂突变体。
3.根据权利要求2所述的磷脂酶A₂突变体的制备方法，其特征在于，所述野生型磷脂酶A₂基
因来自天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)ATCC23899,其核苷酸序列如序列表SEQ ID 
NO：9所示。
4.权利要求1或2所述的磷脂酶A₂突变体的编码基因如序列表SEQ ID NO：10所示。
5.一种包含权利要求4所述的基因的克隆载体、表达载体、以及宿主细胞。
6.根据权利要求5所述的克隆载体、表达载体或宿主细胞，其特征在于，所述的克隆载体为
T载体、所述的表达载体为pBSA43、所述的宿主细胞为枯草芽孢杆菌WB600。
7.权利要求5所述的克隆载体、表达载体或宿主细胞，其特征在于，所述的克隆载体为T
载体、所述的表达载体为pPIC9K、所述的宿主细胞为毕赤酵母GS115。
8.一种包含权利要求4所述的基因的克隆载体、展示载体、以及宿主细胞，其特征在于，
所述的克隆载体为T载体、所述的展示载体为pPIC9K-Flo、所述的宿主细胞为毕赤酵母
GS115。