制备高分子量透明质酸的方法及工程菌

本发明涉及一种制备高分子量透明质酸的方法及工程菌，通过敲除兽疫链球菌（Streptococcus zooepidemicus)ATCC39920基因组中编码透明质酸裂解酶基因(hylb)，本发明构建了透明质酸裂解酶基因(hylb)敲除载体pSET4s::hylb::cmr。本发明将敲除hylb基因的重组菌进行发酵分析，利用特性黏度法测定HA的分子量，得到分子量为3.9×10Da的HA。

1.一种含有透明质酸裂解酶基因的载体，其特征在于：所述的载体将hylb
基因内部1683bp基因片段插入初始载体pSET4s中，构建了中间载体
pSET4s::hylb，再将一段包含氯霉素抗性基因cmr长度为1056bp的基因片段插入
到hylb基因片段中的DraIII位点，形成载体pSET4s::hylb::cmr。
2.根据权利要求1所述的含有透明质酸裂解酶基因的载体，其特征在于：所
述hylb基因内部1683bp基因片段始于hylb基因起始密码子ATG下游202bp，结
束于hylb基因终止密码子TAG上游1310bp，基因序列见序列1。
3.根据权利要求1所述的含有透明质酸裂解酶基因的载体，其特征在于：
所述一段包含氯霉素抗性基因cmr长度为1056bp的基因序列见序列2。
4.一种将权利1要求所述载体pSET4s::hylb::cmr转入宿主菌,特异性敲除
透明质酸裂解酶基因hylb,获得hylb基因功能缺失的工程菌。
5.根据权利要求4所述的工程菌，其特征在于：所述工程菌的宿主菌为兽
疫链球菌（Streptococcus zooepidemicus）ATCC39920。
6.一种制备高分子量透明质酸的方法，其特征在于：使用权利要求4或5
所述的工程菌发酵获得。
7.根据权利要求6所述的制备高分子量透明质酸的方法，其特征在于：所
述发酵获得透明质酸的分子量为3.9×10⁶Da。
8.根据权利要求6所述的制备高分子量透明质酸的方法，其特征在于：所
述工程菌的发酵培养基：蔗糖50g/L，酵母提取物3.5g/L，酪蛋白胨10g/L，NaCl
1.5g/L,K2HPO42g/L，MgSO4·7H2O0.4g/L。
9.根据权利要求6、7、8之一所述的制备高分子量透明质酸的方法，其特
征在于：所述工程菌的发酵条件：5L发酵罐，装液量3L，接种量8%，37℃，
pH7.0，通气量3vvm，发酵20-30小时。