Cu‑64标记的Dimer‑San A环肽衍生物胰腺癌分子探针的制备方法

本发明涉及一种Cu‑64标记的Dimer‑San A环肽衍生物胰腺癌分子探针的制备方法，该方法包括以下步骤：⑴将NOTA‑Dimer‑Sansalvamide A溶解于乙腈，配制成浓度为1μg/μL的多肽溶液；⑵

技术领域
本发明涉及一种探针的制备方法，尤其涉及Cu-64 标记的Dimer-San A环肽衍生物胰腺癌分子探针的制备方法。
背景技术
胰腺癌是世界第五大恶性肿瘤，其中位生存期低于6个月，总的5年生存率低于6%，仅10%的患者适合手术治疗，其预后差与该病未能早期诊断密切相关。随着我国人口的老龄化，胰腺癌在我国的发病率有所增加，其将成为未来几年我国一个主要的健康问题。目前，胰腺癌的常规影像诊断有超声（包括内镜超声）、CT以及MRI，然而这些结构影像对胰腺癌诊断特异性差，胰腺癌与慢性胰腺炎、尤其是慢性肿块性胰腺炎的鉴别诊断是影像医学与临床医学长期以来亟待解决的难题。        ¹⁸F-FDG PET/CT的临床应用，大大提高了胰腺癌诊断的准确性。但¹⁸F-FDG作为一种肿瘤非特异性显像剂，其自身的局限性也显而易见---在胰腺癌的鉴别诊断方面存在假阳性与假阴性。Meta分析研究显示：¹⁸F-FDG PET/CT鉴别诊断胰腺癌与胰腺炎的灵敏度、特异性分别为90%、84%。¹⁸F-FDG制备通过自动化化学合成模块（chemistry process control unit，CPCU），采用软件控制自动合成。合成方法是以1,3,4,6-四-氧-乙酰基-2-氧-三氟甲烷磺酰基-β-D-吡喃甘露糖（简称三氟甘露糖）为原料，在相转移催化剂Kryptofix2.2.2(氨基聚醚2.2.2)促进下， ¹⁸F离子与三氟甘露糖2位上的羟基发生亲核取代反应，生成¹⁸F-FDG保护型的前体，经酸或碱水解脱去乙酰保护基得到¹⁸F-FDG。¹⁸F-FDG PET/CT作为肿瘤非特异性显像剂，在肿瘤早期良恶性鉴别诊断方面存在明显不足：假阳性与假阴性并存，从而导致肿瘤良恶性诊断的误诊与漏诊。为了克服¹⁸F-FDG的不足，有学者标记了CA199抗体片段进行胰腺癌的分子影像诊断，但放射免疫显像不论是使用放射性核素标记单克隆抗体或者其片段，均存在分子量较大，血液清除缓慢（4-20h），在较短时间内难以得到较高的T/NT比值的问题；再者，CA199是胰腺癌非特异性抗原，在胰腺炎性病变中亦有明显表达。受体显像所用的标记配体分子量小、血液清除快、组织穿透力强、T/NT比值高、无免疫原性，具有灵敏度高、特异性强和准确性好等优点，是分子核医学最活跃的前沿研究领域之一。热休克蛋白90（heart shock protein 90，Hsp90）是一种高度保守的在生物界普遍存在、有特殊分子伴侣功能的蛋白，分子量约为83～90KDa。Hsp90含有三个高度保守的结构域：即N端三磷酸腺苷结合域、中间结构域、C末端结构域，以同源二聚体形式存在，主要与细胞周期和细胞凋亡调控相关。研究证实，Hsp90在包括胰腺癌在内的多种恶性肿瘤细胞中异常高表达，是正常细胞的2-10倍，并与肿瘤的发生、发展、分级、分期及预后密切相关；Hsp90在肿瘤细胞质中被激活并定位到细胞表面，而在正常细胞中仅驻留在细胞质中。因此，Hsp90作为一潜在的肿瘤治疗研究靶点日益受到关注，也为其成为靶标的分子影像研究奠定了基础。Sansalvamide A (简称San A) 是1999年由美国Belofsky等从海洋菌属Fusarium中分离出来的一种由两个亮氨酸、一个缬氨酸、一个苯丙氨酸和一个α-羟基异己酸组成的环五肽酯类化合物，具有很高的亲脂性及显著的抗肿瘤能力，其对美国国立癌症研究所的60种恶性肿瘤细胞系具有显著的抗增殖活性，且对包括胰腺癌细胞系在内多种肿瘤细胞具有治疗靶向性。将San A分子中的酯键改造成酰胺键，所得化合物为环五肽（称San A环肽）。研究发现，利用氟、氯、甲氧基等基团取代San A环肽分子中苯环对位氢原子，所得San A 环肽衍生物的抗肿瘤生物活性明显优于San A。San A及其衍生物抗胰腺癌活性的研究，国内尚属空白，而国外研究较多。有学者认为San A具有杀死多种胰腺癌细胞系的重要作用。它的衍生物具有独特的抗癌特性，并与目前抗胰腺癌的药物没有结构同源性。Pan PS等合成了31种San A 环肽衍生物，对两种胰腺癌细胞系(分别是PL45和 BxPC-3)的抗癌活性进行了研究，其中6种衍生物的抗胰腺癌效果是临床常用药物如(如, 5-FU)的140多倍，而正常细胞对其则具有较好的耐受性。到目前为止，合成的San A环肽衍生物有100余种，其抗肿瘤活性差别明显。大量对San A环肽衍生物结构-抗癌效应关系的研究发现，为保证其较高的抗癌活性，该衍生物必须含有两个连续D-氨基酸和/或N-甲氧基。Pan等合成了78种San A环肽衍生物，其中第1号衍生物（简称Diamer San A），显示出最强的抗胰腺癌（PL45、BxPC3）活性，对胰腺癌PL45细胞的半数抑制率（IC₅₀）仅为1-20 nM，是报道的抗胰腺癌活性最强的San A环肽衍生物。        ⁶⁴Cu (T_1/2=12.7h)被国际原子能机构（IAEA）称为“新兴PET核素”，具有广阔的应用前景。与¹⁸F（T_1/2 = 110 min）等PET核素相比，⁶⁴Cu具有相对较长的半衰期(T_1/2 = 12.7 h)，可进行较长时间的显像研究，并且便于核素中长程的运输。⁶⁴Cu同时发射有β⁺电子（17%）和β^-电子（39%），可以用于PET成像和放射性治疗，有望集中放射性核素的诊疗一体化研究。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种有效提高标记率的Cu-64 标记的Dimer-San A环肽衍生物胰腺癌分子探针的制备方法。为解决上述问题，本发明所述的Cu-64 标记的Dimer-San A环肽衍生物胰腺癌分子探针的制备方法，包括以下步骤：⑴将NOTA-Dimer-Sansalvamide A溶解于乙腈，配制成浓度为1 μg/μL的多肽溶液；⑵在37~111 MBq的⁶⁴CuCl₂中加入300 μL 0.1 M 且pH=5.5的乙酸氨 (NH₄OAc) 缓冲液进行反应，得到反应液⁶⁴Cu(OAc)₂；⑶将5~10 μg所述多肽溶液加入到所述反应液⁶⁴Cu(OAc)₂中，于45℃加热45 min，并在加热的过程中持续震荡，得到产物⁶⁴Cu-NOTA-Dimer-Sansalvamide A，简称⁶⁴Cu-NOTA-Dimer-San，其结构式如下：        ；⑷所述产物⁶⁴Cu-NOTA-Dimer-San用悬干机于40ºC除去溶剂，并用含有5% DMSO的磷酸盐缓冲液（PBS）溶解，最后经0.22 μm滤膜过滤，即得⁶⁴Cu标记的Dimer-Sansalvamide A环肽衍生物胰腺癌分子探针。所述步骤⑷中磷酸盐缓冲液的用量与所述标记物⁶⁴Cu-NOTA-Dimer-San的比例为300~500 μL：5~10 μg。本发明与现有技术相比具有以下优点：1、本发明首次以NOTA-Dimer-San分子作为金属离子⁶⁴Cu的标记前体，以Hsp90为显像的靶点，构建⁶⁴Cu标记的NOTA-Dimer-San新型显像剂。本发明以Sansalvamide A衍生物中活性最强的环肽Dimer-Sansalvamide A (简称Dimer-San A)作为标记前体(IC₅₀为1-20 nM)，其结构式如下：                      该标记前体在保留该类衍生物重要活性功能基团的前提下，通过在Dimer-San A分子的苯环上引入氨基，耦联1，4，7-三氮环壬烷-1，4，7-三乙酸（1，4，7-triazacyclononane-1，4，7-triacetic acid，NOTA） 双功能螯合剂，对其进行生物学活性鉴定后，实现正电子放射性核素⁶⁴Cu对其进行间接标记（⁶⁴Cu-NOTA-Dimer-San,简称⁶⁴Cu -NOTA-Dimer-San）。研究证实，San A及其环肽衍生物是Hsp90的抑制剂，其选择性结合于Hsp90的N端及中间解构域，通过阻止Hsp90的C末端结构域与其下游客户蛋白结合，从而干扰涉及细胞生长及肿瘤信号传导的多个通路，导致肿瘤细胞凋亡，且二者结合具有高特异性、高亲和力。2、本发明显像剂⁶⁴Cu-NOTA-San以Hsp90作为显像的靶点，经体外细胞摄取实验证实，其与靶点有较高的结合率，体外阻断实验进一步证实了该显像剂与靶点结合的特异性（参见图1~8）；构建裸鼠胰腺癌模型进行Micro-PET显像，可见肿瘤显像剂摄取明显；静脉注射阻断剂后1 h，再注射显像剂进行显像，可见肿瘤部位未见显像剂摄取，故体内实验进一步证实了该显像剂与靶点Hsp90结合的特异性。【体外细胞摄取与阻断实验】将PL45细胞收集并种植到24孔板（0.5×10⁵细胞/孔），放至温育箱培养24 h (37ºC-, 5% CO₂)。非阻断实验每孔加入相同浓度的显像剂（5 μCi/100 μL）；用于阻断实验的孔先加入100 μL一定浓度的非标记肽，反应30 min后再加入相同浓度的显像剂，进行竞争结合反应，用以证实显像剂与靶点结合有无特异性。加样以后将24孔板温浴不同时间（0、15、30、60、90、120 min），PBS漂洗游离显像剂，胰酶消化、收集细胞后，用γ计数器检测细胞在不同时间显像剂的摄取情况。上述实验重复两次，每孔设置复孔。图1中摄取高的表示一定浓度的显像剂（⁶⁴Cu-NOTA-Dimer-San）在不同时间的细胞摄取情况，60 min时显像剂摄取达到峰值，细胞结合率为36.2±6.8%；摄取较低的曲线表示加入一定阻断剂后细胞摄取下降，60min时细胞结合率降为：23.2±4.2%。两组数据经t检验，存在统计学差异，P<0.05，说明显像剂⁶⁴Cu-NOTA-Dimer-San与靶点Hsp90结合具有特异性。【荷瘤裸鼠模型的建立】待胰腺癌细胞株PL45处于对数增长期时，无菌操作收集细胞，在裸鼠右肩部注射细胞数1×10⁷/只，等肿瘤长至体积100~200 mm³时进行Micro-PET显像。共构建6只肿瘤模型，其中3只用于肿瘤显像，另外3只用于肿瘤竞争结合显像。【荷瘤裸鼠显像】用Micro-PET 小动物扫描仪进行显像。裸鼠用2%异氟烷麻醉后，通过尾静脉注射显像剂（⁶⁴Cu-NOTA-Dimer-San）100-200 µCi/只，分别于2 h、4 h置于俯卧位进行显像（见图2~4）。        ⁶⁴Cu-NOTA-Dimer San肿瘤显像：图2~4可见右侧肿瘤部位显像剂摄取增高。【荷瘤裸鼠竞争结合显像】裸鼠在注射显像剂前1 h，通过尾静脉注射250 µg阻断剂，分别与2 h、4 h进行俯卧位Micro-PET显像。图5~7可见注射阻断剂后，由于阻断剂与显像剂竞争结合同一靶点，原肿瘤高摄取未见显影。进一步通过体内实验证实了显像剂⁶⁴Cu-NOTA-Dimer-San与靶点Hsp90结合的特异性。【荷瘤裸鼠体外分布实验】所述6只裸鼠4h显像后处死，分离肿瘤、血液、心、肝、胰、脾、肾、胆囊、小肠，放入小管，称重，γ计数器测量放射性计数，所得数据经衰减校正后，计算%ID/g（percentage of injected dose per gram of tissue,每g组织注射剂量分数，用来衡量组织器官放射性分布的高低），绘制条形图（参见图8）。非阻断肿瘤的%ID/g为4.66±0.97，阻断以后肿瘤的%ID/g为2.13±0.34，用SPSS 22软件对两组数据进行独立样本t检验，P<0.05，差异有统计学意义。进一步证实了该显像剂为Hsp90特异性显像剂。从图8同时可以看出，该显像剂主要通过肝脏、胆囊、胃肠道等消化系统排泄，胰腺本底相对摄取较低；其次主要通过泌尿系统排泄。3、本发明标记方法简单，不需要专门的化学合成模块，且标记率>97%。4、本发明标记的前体为环肽二聚体，与线性单体肽相比较，稳定性高，显像效果好。5、本发明标记温度较低（45 ºC），一般不会导致标记前体的破坏。6、本发明中⁶⁴Cu同时发射β⁺电子和β^-电子，可以用于PET显像和放射性治疗，⁶⁴Cu标记的NOTA-Dimer-San具有胰腺癌诊疗一体化的潜力。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。图1为本发明⁶⁴Cu-NOTA-Dimer-San细胞摄取实验及体外阻断实验结果。图2为本发明荷瘤裸鼠⁶⁴Cu-NOTA-Dimer San Micro-PET 阳性显像(2 h)。图3为本发明荷瘤裸鼠⁶⁴Cu-NOTA-Dimer San Micro-PET 阳性显像(4 h)。图4为本发明荷瘤裸鼠⁶⁴Cu-NOTA-Dimer San Micro-PET MIP图(4 h)。图5为本发明荷瘤裸鼠⁶⁴Cu-NOTA-Dimer San Micro-PET 竞争显像(2 h)。图6本发明荷瘤裸鼠⁶⁴Cu-NOTA-Dimer San Micro-PET 竞争显像(4 h)。图7为本发明荷瘤裸鼠⁶⁴Cu-NOTA-Dimer San Micro-PET 竞争显像MIP图(4 h)。图8为本发明荷瘤裸鼠体外生物学分布实验（4 h）。
具体实施方式
实施例1 Cu-64 标记的Dimer-San A环肽衍生物胰腺癌分子探针的制备方法，包括以下步骤：⑴将NOTA-Dimer-Sansalvamide A溶解于乙腈，配制成浓度为1 μg/μL的多肽溶液。⑵在37 MBq的⁶⁴CuCl₂中加入300 μL 0.1 M 且pH=5.5的乙酸氨 (NH₄OAc) 缓冲液进行反应，得到反应液⁶⁴Cu(OAc)₂。⑶将5 μg多肽溶液加入到反应液⁶⁴Cu(OAc)₂中，于45℃加热45 min，并在加热的过程中持续震荡，得到产物⁶⁴Cu-NOTA-Dimer-Sansalvamide A，简称⁶⁴Cu-NOTA-Dimer-San。经HPLC(高效液相色谱)分析及分离纯化，标记率为 >97%，其结构式如下：        。⑷产物⁶⁴Cu-NOTA-Dimer-San用悬干机于40ºC除去溶剂，并用含有5% DMSO的磷酸盐缓冲液（PBS）溶解，最后经0.22 μm滤膜过滤，即得⁶⁴Cu标记的Dimer-Sansalvamide A环肽衍生物胰腺癌分子探针。其中：磷酸盐缓冲液的用量与标记物⁶⁴Cu-NOTA-Dimer-San的比例为300 μL：5 μg。实施例2 Cu-64 标记的Dimer-San A环肽衍生物胰腺癌分子探针的制备方法，包括以下步骤：⑴将NOTA-Dimer-Sansalvamide A溶解于乙腈，配制成浓度为1 μg/μL的多肽溶液。⑵在111 MBq的⁶⁴CuCl₂中加入300 μL 0.1 M 且pH=5.5的乙酸氨 (NH₄OAc) 缓冲液进行反应，得到反应液⁶⁴Cu(OAc)₂。⑶将10 μg多肽溶液加入到反应液⁶⁴Cu(OAc)₂中，于45℃加热45 min，并在加热的过程中持续震荡，得到产物⁶⁴Cu-NOTA-Dimer-Sansalvamide A，简称⁶⁴Cu-NOTA-Dimer-San。经HPLC(高效液相色谱)分析及分离纯化，标记率为 >97%，其结构式同实施例1。⑷产物⁶⁴Cu-NOTA-Dimer-San用悬干机于40ºC除去溶剂，并用含有5% DMSO的磷酸盐缓冲液（PBS）溶解，最后经0.22 μm滤膜过滤，即得⁶⁴Cu标记的Dimer-Sansalvamide A环肽衍生物胰腺癌分子探针。其中：磷酸盐缓冲液的用量与标记物⁶⁴Cu-NOTA-Dimer-San的比例为500 μL：10 μg。实施例3 Cu-64 标记的Dimer-San A环肽衍生物胰腺癌分子探针的制备方法，包括以下步骤：⑴将NOTA-Dimer-Sansalvamide A溶解于乙腈，配制成浓度为1 μg/μL的多肽溶液。⑵在74 MBq的⁶⁴CuCl₂中加入300 μL 0.1 M 且pH=5.5的乙酸氨 (NH₄OAc) 缓冲液进行反应，得到反应液⁶⁴Cu(OAc)₂。⑶将8 μg多肽溶液加入到反应液⁶⁴Cu(OAc)₂中，于45℃加热45 min，并在加热的过程中持续震荡，得到产物⁶⁴Cu-NOTA-Dimer-Sansalvamide A，简称⁶⁴Cu-NOTA-Dimer-San。经HPLC(高效液相色谱)分析及分离纯化，标记率为 >97%，其结构式同实施例1。⑷产物⁶⁴Cu-NOTA-Dimer-San用悬干机于40ºC除去溶剂，并用含有5% DMSO的磷酸盐缓冲液（PBS）溶解，最后经0.22 μm滤膜过滤，即得⁶⁴Cu标记的Dimer-Sansalvamide A环肽衍生物胰腺癌分子探针。其中：磷酸盐缓冲液的用量与标记物⁶⁴Cu-NOTA-Dimer-San的比例为400 μL：8 μg。