半夏人工种胚同步化的悬浮培养方法

本发明公开了一种半夏人工种胚同步化的悬浮培养方法，该方法首先以半夏无菌苗叶片或叶柄作为外植体诱导产生愈伤组织，然后通过调整继代培养基及继代次数获得适于悬浮培养的疏松愈伤组织，再经悬浮培养建立半夏微细均一细胞团悬浮体系，最后通过对植物生长调节物质种类和浓度、蔗糖浓度、水解酪蛋白（CH）浓度及光照强度的调节，构建优化的半夏人工种胚同步化培养条件。本发明通过悬浮培养获得半夏同步化人工种胚，有增殖速度快、同步化程度高、脱毒效果好、操作简便等优点，为半夏优质种子种苗产业化技术的构建提供了新的有效途径。

1.一种半夏人工种胚同步化的悬浮培养方法，其特征在于包括如下步骤：步骤1：以半夏叶片或叶柄为外植体，于MS基本培养基添加植物生长调节物质2,4-D1.0～2.0mg/L和6-BA0.5～1.5mg/L中诱导获得愈伤组织；步骤2：挑选步骤1中获得的愈伤组织，以MS为基本培养基，添加2,4-D0.5～2.0mg/L和6-BA0.5～1.5mg/L进行继代增殖培养，每隔25～30d继代1次，连续继代3次后获得适于悬浮培养的颗粒状离散愈伤组织；步骤3：挑选步骤2中获得的颗粒状离散愈伤组织，以不含蔗糖和琼脂的MS液体培养基添加2,4-D0.5～1.5mg/L+6-BA0.2～1.0mg/L+CH100～300mg/L+蔗糖30～50g/L进行悬浮培养，每隔10～15d继代1次，连续继代3次后获得适于进行人工种胚膨大培养的细胞团；步骤4：挑选步骤3中获得的细胞团，以MS+6-BA0.5mg/L+CH300mg/L+蔗糖30g/L液体培养基为基础培养基，分别添加不同浓度的植物生长调节物质2,4-D0～0.5mg/L、NAA0～0.5mg/L、IBA0～2.0mg/L进行细胞团膨大培养，培养至形成乳白色、质地紧密的细胞团；步骤5：将步骤4中的获得的乳白色、质地紧密的细胞团进行过筛处理，挑选其中的微细胞团，置于MS+CH300mg/L+蔗糖10g/L再添加6-BA0～2.0mg/L、IBA0～0.2mg/L的液体培养基中进行分化培养，10～15d后分化形成可用于制作半夏人工种子的同步化人工种胚。
2.根据权利要求1所述的半夏人工种胚同步化的悬浮培养方法，其特征在于：所有培养基pH均调节为5.8，培养温度为（25±1）℃，光照强度2000lx，光照时间12h/d。
3.根据权利要求1所述的半夏人工种胚同步化的悬浮培养方法，其特征在于：步骤1中诱导疏松愈伤组织的外植体为半夏无菌苗叶片，诱导愈伤组织的植物生长调节物质为2,4-D1.0mg/L+6-BA1.5mg/L；或外植体为半夏无菌苗叶柄，诱导愈伤组织的植物生长调节物质为2,4-D1.0mg/L+6-BA1.0mg/L。
4.根据权利要求1所述的半夏人工种胚同步化的悬浮培养方法，其特征在于：步骤2中挑选步骤1中获得的愈伤组织，继代培养基添加的植物生长调节物质为2,4-D2.0mg/L+6-BA1.0mg/L。
5.根据权利要求1所述的半夏人工种胚同步化的悬浮培养方法，其特征在于：步骤3中步骤2中获得的挑选颗粒状离散愈伤组织，以不含蔗糖和琼脂的MS液体培养基，添加2,4-D1.0mg/L+6-BA0.5mg/L+CH300mg/L+蔗糖40g/L，悬浮培养的摇床转速为90r/min，黑暗或弱光培养。
6.根据权利要求1所述的半夏人工种胚同步化的悬浮培养方法，其特征在于：步骤4中挑选增殖快、分散程度高、细胞团呈圆形或卵圆形的悬浮培养物，基础培养基添加IBA1.0mg/L，悬浮培养的摇床转速为75r/min。
7.根据权利要求1所述的半夏人工种胚同步化的悬浮培养方法，其特征在于：步骤5的分化培养基中添加6-BA0.5mg/L和IBA0.05mg/L，悬浮培养的摇床转速为50r/min，光照强度为3500lx。